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饶志明教授团队在Bioresource Technology发表通过理性代谢工程改造谷氨酸棒杆菌结合两阶段pH调控策略高效合成L-谷氨酰胺的研究成果(2019级硕士生吕青兰一作)

来源:生物工程学院   图文:饶志明 审核:刘延峰,周云龙发布时间 :2021-08-31  点击量:

近期,我校生物工程学院饶志明教授团队在L-谷氨酰胺的高效制备方面取得重要进展,研究成果“Enhancing L-glutamine production inCorynebacterium glutamicumby rational metabolic engineering combined with a two-stage pH control strategy”正式发表于Bioresource Technology(IF = 9.642) (https://doi.org/10.1016/j.biortech.2021.125799)。

L-谷氨酰胺是一种半必需氨基酸,由于其特殊的营养及免疫功能,尤其是对肠胃溃疡和大面积烧伤的治疗具有重要作用,近年来被广泛应用于食品、医药和饲料等领域。目前,L-谷氨酰胺的生产方法主要有发酵法、酶法以及化学合成法。酶法合成L-谷氨酰胺存在操作复杂、产量低及反应过程中需要额外加入大量价格昂贵的ATP等缺陷,而化学法合成L-谷氨酰胺存在着严重的环境污染等问题,因此目前常利用微生物发酵法生产L-谷氨酰胺。然而,缺乏高产量高转化率的食品安全菌株以及发酵工艺的不成熟是限制L-谷氨酰胺工业生产的主要原因。

饶志明教授团队针对上述发酵法生产L-谷氨酰胺过程中存在的产量低、转化率低及工艺不成熟等问题,以谷氨酸棒杆菌为出发菌株,采用代谢工程改造结合两阶段pH调控策略高效制备L-谷氨酰胺。首先,通过ARTP诱变及高通量筛选获得了一株产量为25.7±2.7 g/L的谷氨酸棒杆菌N01。接着,以N01为出发菌株进行一系列的理性代谢工程改造,主要包括:(1)增强前体L-谷氨酸富集池及流向L-谷氨酰胺的碳通量。敲除proB基因,阻断脯氨酸支路竞争途径;敲除谷氨酸机械分泌通道蛋白NCgl1221,降低发酵液中副产物L-谷氨酸含量,同时使更多的前体L-谷氨酸在胞内积累从而促进L-谷氨酰胺的高效合成。(2)提高关键酶谷氨酰胺合成酶(GS)的催化活性。敲除谷氨酰胺合成酶腺苷酰化转移酶GlnE,解除GS的腺苷酰化作用;通过筛选8种不同来源的GS酶,获得了一种酿酒酵母来源的具有高催化活性的GS,并用质粒pXMJ19进行异源过表达。(3)通过引入基于PPK的ATP再生系统增强胞内ATP供应。串联表达大肠杆菌来源的多聚磷酸盐激酶ppk,增强胞内ATP再生。(4)利用RBS工程优化串联质粒pXMJ19-glnA-ppk基因表达水平。最后,为解决菌体生长和发酵产酸之间的不平衡,提出了pH分阶段调控策略并优化了pH,从而实现了L-谷氨酰胺产量的大幅度增长。最终的工程菌在5L发酵罐中L-谷氨酰胺的最高产量为73.5±3.1 g/L,糖胺转化率为0.368±0.034 g/g葡萄糖。本研究为已报道的利用谷氨酸棒杆菌生产L-谷氨酰胺的最高产量,为工业生产L-谷氨酰胺及相关的高价值产品提供了一系列有效的策略。

图形摘要

饶志明教授为论文的通讯作者,我校2019级硕士生吕青兰为第一作者。上述研究得到了国家重点研发计划项目(2021YFC2100900)、国家自然科学基金(31770058)以及宁夏回族自治区重点研发计划项目(2019BCH01002)等资助。

近年来饶志明教授团队以合成生物学科学理论为指导,在系统开展高效合成高值化合物细胞工厂构建及产业化方面取得丰硕成果,相关研究成果已发表在Science Advances (2020)、Nature Communication (2018)、ACS Catalysis (2018)、Advanced Materials (2018)、Bioresource Technology (2017、2020)、Green Chemistry (2016)、Metabolic Engineering (2016)等本领域权威期刊。

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